Paper
Cao, Sen, et al. "Accurate structure prediction of cyclic peptides containing unnatural amino acids using HighFold3." Briefings in Bioinformatics 26.5 (2025): bbaf488.
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Abstract
Cyclic peptides have emerged as a research hotspot in drug development in recent years due to their excellent stability, specificity, and cell penetration. However, existing computational models face challenges in accurately predicting the three-dimensional structures of cyclic peptides containing unnatural amino acids (unAAs), thereby limiting their drug design. The release of AlphaFold 3 has significantly enhanced the modeling capability of biomolecular complexes and enabled the inclusion of unAAs through definitions provided by the Chemical Component Dictionary (CCD). Nevertheless, its training data reliance limits its ability to accurately predict cyclic peptide structures, failing to meet the demand for precise cyclic peptide structure prediction. Based on the AlphaFold 3 framework, we developed HighFold3 by introducing the Cyclic Position Offset Encoding Matrix (CycPOEM). HighFold3 comprises two submodels: HighFold3-Linear and HighFold3–Cyclic, designed for predicting the structures of linear and cyclic peptides, respectively. Our results demonstrate that HighFold3 outperforms existing models (HighFold, HighFold2, CyclicBoltz1, NCPepFold, CABS-flex, ESMFold, and HelixFold) in cyclic peptide structure prediction. It achieves atomic-level precision in predicting cyclic peptide monomers while demonstrating enhanced accuracy and generalization capability for cyclic peptide complexes containing unAAs. This offers unprecedented technical support for the structural design and optimization of cyclic peptide–based therapeutics.
[Problem]
- AF3가 나왔지만, 여전히 cyclic peptide & unnatural amino acid는 정확하게 예측하지 못한다. (Cyclic peptide 현재 drug development에서 hotspot임.)
[Solution]
- AF3의 framework는 유지하면서, cyclic position 정보를 알려주는 encoding matrix (CycPOEM)을 추가했다. 재학습 없이 입력만 바꿔서 문제를 해결하고자 함.
[Contribution]
- atom-level precision 달성
Motivation
[1] Train 데이터 편향
AF3와 HigFold3 비교
- AF3은 주로 선형 단백질 구조로 구성된 기존 단백질 데이터베이스에 의존
- [A]에서 cyclic peptide(9HVC)를 AF3로 예측한 결과 N-말단과 C-말단 사이의 거리가 20Å 이상 떨어진 linear 구조로 잘못 예측 → AF3가 고리형 구조의 topology를 인식하는 데 한계가 있음을 보여준다.
[2] 같은 서열, 다른 구조 문제
- 동일한 펩타이드 서열이 합성 조건이나 환경에 따라 선형이 될 수도, 고리형이 될 수도 있다.
- 예를 들어, KLARLLT라는 서열은 선형으로도, Cyclo(KLARLLT)로도 존재한다. (Williams TM, Sable R, Singh S. et al. Peptide ligands for targeting the extracellular domain of EGFR: Comparison between linear and cyclic peptides. Chem Biol Drug Des 2018;91:605–19.)
- 기존 모델(AF3)은 구분 X
- 하지만, 그림처럼 HighFold3는 동일 서열의 다른 conformational 상태를 예측했다.
[3] unatural amino acids (unAAs) 제한
- 기존 모델들(CABS-flex, ESMFold, and HelixFold)은 아예 불가능한 상태이다.
Concept
[1] Cyclic peptide
- 펩타이드 치료제는 표적에 대한 높은 특이성과 낮은 독성으로 현재 신약 개발 분야에서 널리 활용되고 있다.
- 일반적으로 50개 이하의 아미노산으로 구성되어 있으며 약물 개발 및 치료 목적으로 합성되거나 자연적으로 존재할 수 있다.
- 그 중에서도 cyclic peptide는 우리가 흔히 아는 선형 펩타이드와는 다르게 위의 그림처럼 constrain을 줘서 고리 형태의 펩타이드로 존재한다.
- 선형 펩타이드는 말단 부분에서 우리 몸에 존재하는 효소에 의해 쉽게 분해될 수 있지만, cyclic peptide는 그런 위험성을 줄여준다.
[2] unAAs (Unnatural Amino Acids)
- 자연계 20가지 표준 아미노산이 아닌 화학적으로 합성되거나 변형된 아미노산
[3] Disulfide bond
- 두 Cysteine residue의 S 원자 사이에 형성되는 covalent bond, 펩타이드 3차 구조 안정화
[4] RMSD
- $RMSD_{Cα}$: $Cα$ 탄소 원자만 비교
- $RMSD_{all-atom}$: 모든 원자 비교
- $RMSD_{unAA}$: unAAs 부분만 비교
[5] pLDDT (predicted Local Distance Difference Test)
- AF 모델들이 출력하는 신뢰도 점수 (0~100)
- 높을수록 해당 residue prediction이 신뢰할 만하다.
[6] CCD (Chemical Component Dictionary)
- PDB에 등록된 모든 residue와 저분자에 대한 화학 정보를 관리하는 데이터베이스이다.
- standard and modified amino acids/nucleotides, small molecule ligands and solvent molecules 등 포함한다. (Westbrook, John D., et al. "The chemical component dictionary: complete descriptions of constituent molecules in experimentally determined 3D macromolecules in the Protein Data Bank." Bioinformatics 31.8 (2015): 1274-1278.)
- 그림처럼 mmCIF 형태로 저장된다.
Solution
[Overview] HighFold3 framework
- AF3의 pretrained model을 frozen 상태로 유지하면서, input features만 조정하여 cyclic peptide를 인식하게 한다.
- 이유: small-sample cyclic peptide dataset으로 학습할 때 발생할 수 있는 overfitting 문제를 회피
Cyclization Switch
- Boolean parameter "head_to_tail"로 전환
- head_to_tail = False → Linear Matrix (HighFold3-Linear)
- head_to_tail = True → Cyclic Matrix (HighFold3-Cyclic)
[1] CycPOEM (Cyclic Position Offset Encoding Matrix)
Linear position matrix
- 가까운 아미노산 residue 간 sequence interval = 1
- N-말단과 C-말단 사이의 거리 = 전체 펩타이드 길이 - 1
- 모델은 사슬의 양 끝이 멀리 떨어진 열린 구조로 인식
- 그림 B는 길이가 7인 linear peptide의 예시
Cyclic position matrix
- N-말단과 C-말단을 직접 연결하여 거리를 1로 설정
- closed loop의 거리 정보를 matrix에 encoding
- 모델이 펩타이드가 닫힌 구조임을 인식
Step 1: 초기 distance matrix $D$ 구성
- 길이가 $N$인 cyclic peptide sequence $S$에 대해 $N$ X $N$ distance matrix $D$를 생성한다.
- 여기서 $D[i,j]$는 아미노산 $i$와 $j$ 사이의 초기 거리를 나타낸다.
- Rule:
1. 자기 자신과의 거리: $D[i,i]$ = $0$
→ 어떤 residue라도 자기 자신까지의 거리는 0
2. 가까운 아미노산 간 거리: $D[i, i+1]$ = $1$ 및 $D[i+1,i]$ = $1$
→ sequence에서 연속된 아미노산 $i$와 $i+1$ 사이의 거리는 $1$
3. Head-to-tail 연결 (cyclic peptide 핵심): $D[0, N-1]$ = $1$ 및 $D[N-1, 0]$ = $1$
→ N-말단(0번)과 C-말단($N-1$번)을 거리 1로 직접 연결
Step 2: Floyd-Warshall 기반 최단 경로 계산 (FCP 알고리즘)
- 모든 residue 간의 최단 경로 계산
- $i$에서 $j$ distance와 $i$에서 $k$를 거쳐 $j$로 가는 distance 중 더 짧은 경로를 선택한다. (모든 k에 대해 반복)
- Example
- residue: 0-1-2-3-4-5-6-
Q. 0에서 4까지의 최단 거리는?
- 경로 1. 0-1-2-3-4, distance = 4
- 경로 2. 0-6-5-4, distance = 3
A. 최단거리는 3이다. 그래서 Cyclic Position Matrix를 볼 때 $D[0,4]=3$이다.
- 최단 거리만으로는 펩티드 결합의 방향을 알 수 없으므로 부호를 추가 ($a$는 아미노산 $i$,$j$는 번호)
- 방향을 나타내는 방법?
그림처럼 N-C 말단의 순서를 생각해서 연결 지으면 된다.
- 최종적으로 거리 $D$와 방향 $T$를 결합하여 CycPOEM matrix 생성
[2] Disulfide Bond Combination Matrix (CSDB)
- Disulfide bond: 두 cysteine(C) residue가 S 원자끼리 연결되는 결합
- Cysteine이 여러 개 있으면, 어떤 cysteine끼리 연결될지 여러 조합이 가능하다.
- Example
Cysteine A, B, C 세 개 있으면 (A, B), (A, C), (B, C)
→ 모델이 모든 가능한 조합을 고려해야 정확한 구조를 예측할 수 있다.
Step 1: Cysteine 위치 확인
- CXXCXCXX
- Sequence를 보고 모든 cysteine의 위치를 벡터 Vc에 저장한다.
- $V_{c}$ = [1, 4, 6]
- $M$ = 3 (cystenine 총 3개)
Step 2: 최대 disulfide bond 수 계산
- Disulfide bond는 2개의 cysteine이 쌍을 이룬다.
- $M$이 짝수면 $K_{max}$ = $M$
- $M$이 홀수면 $K_{max}$ = $M-1$
- 여기서는 홀수이므로 $K_{max}$ = $M-1$ = $2$
Step 3: 모든 조합 생성
- Outer loop: pairing에 참여하는 cysteine 수 $k$ (2부터 $K_{max}$ 까지, 2씩 증가)
- Inner loop: $M$개 중 $k$개를 선택해서 candidate subset 생성
| $k$ | 선택되는 cysteine 수 | 가능한 subset |
| 2 | 2개 | {1,4}, {1,6}, {4,6} |
Step 4: 최종 combination matrix
- Disulfide bond를 형성하는 residue pair는 초기 distance matrix에서 distance를 1로 설정한다.
- Linear 또는 cyclic positional offset matrix와 결합하여 modeling
[3] 추가 확장 기능: mutiple cyclic peptide ligand 예측
- 하나의 target protein에 여러 cyclic peptide ligand가 결합한 complex 구조 동시 예측
- C1, C2, C3: 각 cyclic peptide ligand의 CycPOEM
- P: Target protein의 linear positional matrix
- 0: 서로 다른 분자 간에는 positional 관계 없음
Method & Result
[1] Experimental setup
- Experimental settings
| Workstation | Details |
| CPU | Intel Xeon Gold 6430 (64 cores) |
| GPU | NVIDIA A800 80GB × 4 (총 320GB VRAM) |
| RAM | 500 GB |
| Storage | 40 TB |
[2] Metrics
(1) $RMSD_{Cα}$
- $Cα$ 원자 좌표만 사용한 $RMSD$
- 계산:
1. $Cα$ 좌표 기반 Kabsch 알고리즘으로 rigid superposition (두 구조의 centroid를 원점으로 이동 시키고, $RMSD$가 최소가 되도록 회전)
2. Monomer: 전체 chain에서 계산
3. Complex: 40개 미만 residue chain을 peptide로 정의
- 의미: 펩타이드 backbone의 전체적인 fold가 얼마나 일치하는지
(2) $RMSD_{all-atom}$
- 모든 원자 좌표를 사용한 $RMSD$
- 계산 방식은 $RMSD_{Cα}$ 와 동일하다
- 의미: Side chain을 포함한 전체 구조의 정확도
(3) $RMSD_{unAA}$
- Unnatural amino acid 부분의 $RMSD$
- 계산:
1. unAA 중심으로부터 10 Å 반경 내 원자 좌표 추출
2. Local superposition
3. 여러 unAA가 있으면 평균값 사용
- 의미: unAA가 포함된 부분의 local 구조 정확도
[3] Baseline model
| Model |
| HighFold |
| HighFold2 |
| CyclicBoltz1 |
| NCPepFold |
| CABS-flex |
| ESMFold |
| HelixFold |
| AlphaFold 3 |
[4] Molecular docking 검증
- Tool: ZDOCK 3.0.2 (online server)
- Rigid-body fast Fourier transform 알고리즘
- Rotational + translational space 전역 탐색
- 사전 binding site 정보 없이도 작동
- Built-in scoring function으로 docking pose 순위화
[5] Dataset: To evaluate the predictive performance
(1) Cyclic peptide monomer dataset
| Source | Sample (count) | Model |
| AFCyCDesign | 63 | HighFold, CyclicBoltz1, ESMFold, HelixFold |
| AFCyCDesign | 21 | CABS-flex |
[A] $RMSD_{Cα}$ distribution: HighFold vs HighFold3
- 63 sample
- HighFold (1.478 Å)에 비해 HighFold3 (1.338 Å)가 더 낮은 평균 RMSD
[B] pLDDT vs $RMSD_{Cα}$ correlation
- 63 sample
- 신뢰도(pLDDT)와 예측 정확도(RMSD) 간의 관계
- X: pLDDT (모델의 신뢰도 점수, 0-100)
- Y: $RMSD_{Cα}$ (낮을수록 정확)
- Pearson correlation: -0.67 (negative correlation)
- pLDDT가 높으면 예측이 정확할 가능성 높음
pLDDT > 0.90인 영역에서 대부분 $RMSD_{Cα}$ < 1.5 Å
[C] Disulfide bridge result
- Disulfide bond 개수별 예측 정확도
- 1개 disulfide에서 가장 큰 개선 (33%)
- 모든 경우에서 HighFold3가 우수
[D] $RMSD_{Cα}$ distribution: CABS-flex vs HighFold3
- 21 sample
- CABS-flex (4.022 Å)에 비해 HighFold3 (1.482 Å)가 더 낮은 평균 RMSD
[E] $RMSD_{Cα}$ distribution: ESMFold vs HighFold3
- 63 smaple
- ESMFold (2.982 Å)에 비해 HighFold3 (1.338 Å)가 더 낮은 평균 RMSD
[F] $RMSD_{Cα}$ distribution: HelixFold vs HighFold3
- 63 smaple
- HelixFold (2.643 Å)에 비해 HighFold3 (1.338 Å)가 더 낮은 평균 RMSD
[G] Comparison of HighFold3 predicted structure (PDB ID: 2LWU) with the native structure
- 구조: PawS-derived peptide
- 초록색(예측 구조) vs 회색(실험 구조)
[H] Comparison of HighFold3 predicted structure (PDB ID: 2 M79) with the native structure
- 구조: Theta defensin
- 분홍색(예측 구조) vs 회색(실험 구조)
[I] Comparison of HighFold3 predicted structure (PDB ID: 6U7R) with the native structure
- 구조: SFTI derivative
- 파랑색(예측 구조) vs 회색(실험 구조)
(2) Cyclic peptide complex dataset
| Dataset | Source | Sample (count) | Model |
| Internal | ADCP | 17 | HighFold |
| External | CyclicBoltz1 | 15 | CyclicBoltz1 |
- Internal은 HighFold 이전 시리즈에서 사용한 데이터 셋, External은 다른 model에서 사용한 데이터 셋으로 공정한 비교를 위함.
[A] Internal dataset: HighFold vs HighFold3
- 17 cyclic peptide-protein complex
- Ligand (cyclic peptide)의 $RMSD_{Cα}$ 분포
- HighFold (0.359 Å)에 비해 HighFold3 (0.305 Å)가 더 낮은 평균 RMSD
[B] External dataset: CyclicBoltz1 vs HighFold3
- 15 cyclic peptide-protein complex
- 각 sample에서 두 모델 비교 그래프
- HighFold3 14 / CyclicBoltz1 1
[C] PDB 3AVB
- 구조: HIV integrase + cyclic peptide inhibitor complex
[D] PDB 6VXY
- 구조: Beta-trypsin + inhibitor complex
[E] PDB 5LSO, [F] PDB 6D3X
- ZDOCK 검증
(+) Ablation study
- CycPOEM가 진짜 중요한가? 실험
- 방식: CycPOEM를 제거하고 성능 변화 관찰
[A] Internal dataset: Full model vs w/o CycPOEM
- 17 cyclic peptide complex
| Model | 평균 $RMSD_{Cα}$ |
| Full model | 0.305 Å |
| w/o CycPOEM | 0.804 Å |
[B] External dataset: Full model vs w/o CycPOEM
- 15 cyclic peptide complex
| Model | 평균 $RMSD_{Cα}$ |
| Full model | 0.612 Å |
| w/o CycPOEM | 1.032 Å |
[C] PDB 5TU6: without CycPOEM, (D) PDB 5TU6: With CycPOEM (Full model)
(3) Cyclic peptide dataset containing unAAs
| Source | Sample (count) | Details | Model |
| HighFold2 | 34 | Monomer + Complex | HighFold2 |
| HighFold2 + NCPepFold | 33 | - | NCPepFold |
[A] $RMSD_{Cα}$ distribution: HighFold2 vs HighFold3
- 34 cyclic peptide with unAAs (monomer + complex)
- HighFold2 (2.152 Å)에 비해 HighFold3 (1.907 Å)가 더 낮은 평균 RMSD
[B] $RMSE_{all-atom}$ distribution
- 모든 원자 기준 (side chain 포함)
- HighFold2 (3.436 Å)에 비해 HighFold3 (2.929 Å)가 더 낮은 평균 RMSD
[C] $RMSE_{unAA}$ distribution
- unAA 부분만 따로 측정
- HighFold2 (2.965 Å)에 비해 HighFold3 (2.372 Å)가 더 낮은 평균 RMSD
Correlation
- [D] $RMSD_{Cα}$ : -0.52
- [E] $RMSE_{all-atom}$ : -0.34
- [F] $RMSE_{unAA}$ : -0.78
- NCPepFold랑 비교한 결과
[G] PDB 2PM5
- 구조: Human alpha-defensin 1 derivative (cyclic peptide monomer with unAAs)
[H] PDB 3WNG
- 구조: HIV-1 cyclic peptide complex (cyclic peptide + protein, with unAAs)
(4) Linear peptide dataset
| Source | Sample (count) | Details | Model |
| HighFold2 | 36 | Monomer + Complex (unAAs 포함) | HighFold2 |
- HighFold2랑 비교한 결과
(5) Cyclic and linear peptide sequence dataset (구조가 없는 서열 dataset)
| Database | Cyclic (count) | Linear | Purpose |
| CyclicPepedia | 100 | - | Cyclization success rate |
| CPPsite, ParaPep | - | 100 | Accuracy in linear structure prediction |
- AF3랑 비교한 결과
Conclusion
- HighFold3는 AF3에 cyclic position offset encoding matrix (CycPOEM)를 도입해서 재학습 없이 입력 feature 조정만으로 cyclic peptid의 구조를 기존 모델 대비 최대 33% 높은 정확도로 예측하며, 100개 test 서열에서 100% head-to-tail cyclization 성공 rate를 달성했다.
- 하지만, 동적인 모델링 X, 실험적 검증 X, AF3 의존성 등의 한계도 존재한다.